分光光度计是用不连续的波长采样反射物体或透射物体的一种测量仪器。由于不同物体分子的结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物体都具有特定的吸收光谱。能从含有各种波长的混合光中，将每一种单色光分离出来，并测量其强度的仪器叫做分光光度计。
在使用过程中，由于机械振动、温度变化、灯丝变形、灯座松动或更换灯泡等原因，经常会出现刻度盘上的读数与实际通过溶液的波长不符合的现象，因而导致仪器灵明度降低，影响测定结果的精度，需要进行检验。
检验波长准确度方法是用干涉滤光片或镨钕滤光片测量仪器的吸收峰值, 如果测出的值与滤光片标准值之差超出规程规定, 则需要进行波长调节。
使用分光光度计的步骤与方法:
预热仪器：
为使测定稳定，将电源开关打开，使仪器预热20min，为了防止光电管疲劳，不要连续光照。预热仪器时和在不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。
选定波长：
根据实验要求，转动波长调节器，使指针指示所需要的单色光波长。
固定灵敏度档：
根据有色溶液对光的吸收情况，为使吸光度读数为0.2～0.7，选择合适的灵敏度。为此，旋动灵敏度档，使其固定于某一档，在实验过程中不再变动。一般测量固定在“1”档。
调节“0”点：
轻轻旋动调“0”电位器，使读数表头指针恰好位于透光度为“0”处（此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断，光电管不受光照）。
调节T=100%：
将盛蒸馏水(或空白溶液或纯溶剂)的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，有色溶液放在其它格内，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，转动光量调节器，使透光度T=100%，即，表头指针恰好指在T=100%处。
光具有与其波长成反比的一定量的能量。因此，较短波长的光携带更多的能量，而较长波长的光携带较少的能量。需要特定量的能量来将物质中的电子提升到更高的能量状态，我们可以将其检测为吸收。物质中不同键合环境中的电子需要不同的特定能量来将电子提升到更高的能量状态。这就是为什么在不同物质中对不同波长会发生光吸收的原因。人类能够看到一系列可见光，从大约380nm（我们看到的紫色）到780nm（我们看到的红色）。紫外光的波长比可见光短，约为100nm。因此，光可以通过其波长来描述，这在UV-Vis光谱中可用于通过定位与最大吸光度相对应的特定波长来分析或识别不同的物质（参见下文中UV-Vis光谱的应用部分）。
分光光度法是比色法的发展。比色法只限于在可见光区，分光光度法则可以扩展到紫外光区和红外光区。分光光度法则要求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超过3－5nm，在紫外区可到1nm以下，来自棱镜或光栅，具有较高的精度。
